Das Projekt hätte in seiner jetzigen Variante schwerwiegende ökologische Folgen für die Stadt Stuttgart. Durch den Bau des neuen Stadtviertels auf dem jetzigen Gleisfeld würde die Frischluftschneise der ohnehin schon stark belasteten Stadt abgeriegelt. Der "Stuttgarter Kessel" würde sich im Sommer noch stärker aufheizen.
Ungeklärt ist auch die Frage der Mineralquellen. Experten befürchten, dass der Bau des Tiefbahnhofs die Quellen, die teilweise unter dem Baugelände liegen, schädigen könnte. Insbesondere besteht das Risiko, dass verunreinigtes Grundwasser in die tiefer gelegenen Mineralwasserschichten eindringen könnte.
Und nicht zuletzt sind die Bauarbeiten selbst ein schwerwiegender Einschnitt in das Ökosystem Mittlerer Schlossgarten. In der "grünen Lunge" Stuttgarts sollen 282 teilweise jahrhundertalte Bäume gefällt, 6,8 Milliarden Liter Grundwasser abgepumpt und Lebensräume von geschützten Tierarten wie dem Juchtenkäfer und Fledermäusen zerstört werden. Der BUND engagiert sich in diesem Zusammenhang besonders für den Artenschutz und hat entsprechende juristische Schritte eingeleitet.
Auch für den Klimaschutz ist das Prestigeprojekt alles andere als ein Meilenstein. Durch "Stuttgart 21" wird kein Verkehr vom Auto auf die Schiene verlagert werden. Die Projektbefürworter rechnen zwar damit, dass durch "Stuttgart 21" jährlich rund 177.000 Tonnen CO2 eingespart werden können. Was auf den ersten Blick beachtlich erscheint, entpuppt sich auf den zweiten Blick als wenig überzeugend. Die Verringerung der Emissionen bezieht sich nämlich ausschließlich auf die verkehrlichen Auswirkungen der Neubaustrecke Wendlingen-Ulm, die von den Projektgegnern nicht in Frage gestellt wird. Der milliardenteure Tunnelbahnhof selbst verringert die CO2-Emissionen um kein einziges Gramm - was nicht weiter verwundert, da im neuen Bahnhof aufgrund seiner mangelnden Leistungsfähigkeit kaum mehr Züge verkehren können als im bestehenden Kopfbahnhof.
Entscheidend für einen sachgerechten Vergleich ist die Gesamtökobilanz des Projekts, der "ökologische Rucksack". Denn zum Beispiel belastet auch der Bau und Unterhalt der Tunnel, Brücken, Bahnhöfe und Gleise die Umwelt und verursacht CO2-Emissionen. Hier sieht Stuttgart 21 ganz schön alt aus. Allein die Beton- und Stahlherstellung für die Tunnelstrecken (ohne den Bahnhof) verursacht einen Ausstoß von mindestens 0,8 Millionen Tonnen CO2. Da das Alternativkonzept "K 21" mit viel weniger Tunnelbauten auskommt, ist sein ökologischer Rucksack mit einem Drittel (0,28 Millionen Tonnen CO2) viel kleiner. Bei "Stuttgart 21" würde es etwa elf Jahre dauern, bis der riesige CO2-Rucksack durch Emissionsvermeidung wieder abgebaut wäre - bei "K 21" dauert dies nur etwa vier Jahre. Damit ist "K 21" das ökologisch deutlich bessere Projekt. Selbst die Bahn musste bei den Schlichtungsgesprächen zugeben, dass sie weder für den Tunnelbahnhof noch für die Neubaustrecke Wendlingen-Ulm eine umfassende Ökobilanz erstellt hat.
Der geplante Tiefbahnhof wird zudem dauerhaft sehr viel Energie verbrauchen, während der als Solarbahnhof modernisierte Kopfbahnhof einen Beitrag zum Klimaschutz leisten kann.